论文《藤黄酸诱导人结肠癌细胞凋亡研究》-仁创编译转载

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　　[摘要]目的：探讨藤黄酸对不同发生途径的人结直肠癌细胞凋亡的影响。方法：采用AnnexinV-FITC/PI双染法，检测藤黄酸给药后对HCT116及SW480细胞凋亡的影响。结果：0.25、0.5、1.0μg/mL浓度的藤黄酸对HCT116细胞的总凋亡率分别为25.98%、31.08%、37.94%，各浓度的藤黄酸对HCT116细胞的总凋亡率与空白对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)，并且呈浓度依赖性;0.25、0.5、1.0μg/mL浓度的藤黄酸对SW480细胞的总凋亡率分别为8.36%、35.05%、38.93%，各浓度的藤黄酸对SW480细胞的总凋亡率与空白对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)，并且呈浓度依赖性。结论：藤黄酸对人结肠癌细胞有较好的促凋亡作用。

　　[关键词]结直肠癌;HCT116;SW480;细胞凋亡;肿瘤;藤黄酸

　　结直肠癌是严重威胁人类健康，具有较高致死率的恶性肿瘤。近年来，其发病率呈现逐年升高的趋势[1-2]。近年来中医药在治疗恶性肿瘤等难治性疾病方面越来越受到人们的关注[3-4]。中药藤黄具有杀虫攻毒、消肿敛疮的功效，常用于治疗溃疡湿疮、跌打肿痛、痈疽肿毒等。前期研究发现[6-7]，藤黄提取物藤黄酸能够显著抑制结直肠癌肿瘤细胞的增殖，诱导细胞周期阻滞，促使结肠肿瘤凋亡[8-12]。本研究通过观察体外实验藤黄酸对不同发生途径的人结肠癌细胞株的影响，探讨其作用机制。

　　1材料与方法

　　1.1实验药物藤黄酸由南京源端生物科技公司提供，经南京中医药大学药学院鉴定。1.2细胞培养人结肠癌细胞HCT116和SW480(美国ATCC公司)。将HCT116和SW480细胞培养于RPMI-1640培养基中，该培养液中还应包含10%胎牛血清，青霉素及链霉素各100U/mL。将细胞置于37℃、5%CO2，有一定湿度的恒温箱中进行培养。每2～3d进行一次传代，待细胞处于对数生长期时进行实验。1.3试剂RPMI-1640培养基(美国GIBCO公司);胎牛血清(FBS，美国GIBCO公司);AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒(凯基生物公司);胰蛋白酶消化液及磷酸盐缓冲液(PBS，南京源端生物公司);PI染料(北京雷根生物公司)。1.4仪器流式细胞仪(Becton-DickinsonBD公司);CO2培养箱(美国ThermoFisherScien-tific公司);低速离心机(德国Eppendorf公司);倒置显微镜(日本Olympus公司)。1.5实验方法采用AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况。将HCT116、SW480细胞置于37℃、5%CO2环境中进行培养，传代培养至对数生长期，将该期细胞消化计数，以5×104个/孔的密度将细胞铺入6孔板中。待细胞贴壁变形后，加药处理，空白对照组不给予药物干预;其他组药物干预48小时后，用无乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化收集细胞于各流式管中，PBS洗涤3遍;用离心机转速1000rpm，离心5分钟后收集细胞，弃除上清，每管加入500μL连接缓冲液(BindingBuffer)重悬细胞;往各管加入5μLAnnexinV-FITC染料混匀，再加入5μLPI染料混匀，室温环境下避光反应20分钟;运用流式细胞仪检测，观察细胞凋亡情况。见表1。1.6统计学方法采用SPSS16.0处理相关数据，计量资料用(χ±s)表示，多组间的比较使用单因素方差分析(ANOVA)，组间比较使用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

　　2结果

　　2.1藤黄酸对HCT116细胞凋亡的影响浓度为0.25、0.5、1.0μg/mL的藤黄酸对HCT116细胞的早期凋亡率分别为11.02%、13.68%、13.62%，晚期凋亡率分别为14.96%、17.4%、24.32%，总凋亡率分别为25.98%、31.08%、37.94%，呈浓度依赖性。各浓度藤黄酸对HCT116细胞的总凋亡率与空白对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)，并且呈浓度依赖性。见图1—2。2.2藤黄酸对SW480细胞凋亡的影响浓度为0.25、0.5、1.0μg/mL的藤黄酸对SW480细胞的早期凋亡率分别为4.62%、14.82%、16.21%，晚期凋亡率分别为3.74%、20.23%、22.72%，总凋亡率分别为8.36%、35.05%、38.93%，呈浓度依赖性。各浓度藤黄酸对SW480细胞的总凋亡率与对照组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)，并且呈浓度依赖性。见图3—4。

　　3讨论

　　近年来，我国结直肠癌的发病率呈现出逐年升高的趋势[7]。目前，该病的治疗主要依靠手术切除，并配合放、化疗和其他辅助治疗。中医药在诊治肿瘤等恶性疾病方面发挥着巨大作用，不仅可以改善患者的临床症状，提高生活质量，还可以降低肿瘤转移率和术后复发率。有报道[13]显示，藤黄可以通过干预肿瘤细胞的多种生物学行为，产生强烈的抗肿瘤作用。肿瘤的发生、发展与多种机制相关，其与肿瘤细胞的无限增殖和侵袭密切相关。目前，诱导肿瘤细胞凋亡已经成为治疗结直肠肿瘤的重要目标。为了明确藤黄的有效成分藤黄酸对结直肠肿瘤细胞是否有促凋亡作用，我们进行了本实验研究。在本研究中，我们采用AnnexinV-FITC/PI双染法检测不同浓度藤黄酸干预的HCT116及SW480细胞。结果发现，各浓度的藤黄酸对不同发生途径的人结直肠癌细胞均有促凋亡作用，与空白对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)，且呈浓度依赖性。综上所述，藤黄酸可有效诱导结直肠肿瘤细胞凋亡，影响肿瘤细胞的生物学行为，进而抑制其生长。

　　作者：王微 李悠然 陈邑歧 吴旻娜 韩笑 谷云飞 单位：南京中医药大学 南京中医药大学附属江苏省中医院

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