论文《Th17在慢性牙周炎患者外周血的表达》-仁创编译转载

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　　【摘要】目的探讨趋化因子CCL20及其受体CCR6、Th17细胞在慢性牙周炎患者外周血中的表达。方法收集慢性牙周炎患者42例为病例组,牙周健康者30例为对照组。采用流式细胞术检测外周血Th17细胞表达水平，采用酶联免疫吸附实验(ELISA)测定血浆中CCL20、CCR6及IL-17的浓度，并分析CCL20、IL-17及Th17与牙周袋深度(probingdepth,PD)的相关关系。结果与正常组比较，病例组CCL20、CCR6、IL-17和Th17表达水平均明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)。相关性分析表明CCL20、Th17和IL-17与PD呈正相关关系(P<0.05)。结论CCL20、CCR6与Th17表达水平上调，推测与慢性牙周炎的发病有关。

　　【关键词】慢性牙周炎;Th17细胞;CCR6;CCL20

　　慢性牙周炎(chronicperiodontitis，CP)是一种常见的口腔疾病。研究表明，牙周炎的进展可能受宿主免疫与牙周病致病菌相互作用的影响[1]。CD4+T细胞是炎症反应中重要的免疫细胞，并且介导的适应性免疫应答在宿主免疫中发挥关键作用[2]。Th17是新近发现的一类CD4+T细胞亚群细胞，以高分泌IL-17为特征。体外实验表明，CC亚族趋化因子配体20(chemokineligand20，CCL20)及其唯一受体6(chemokinereceptor6,CCR6)特异性表达于Thl7细胞表面，能介导和调节Thl7细胞趋化至炎症部位[3]。趋化因子和趋化因子受体的调控作用使Thl7细胞移动到特定部位是其致炎机制之一。本研究拟探讨Th17细胞亚群及CCL20-CCR6在慢性牙周炎患者外周血中的表达及临床意义。

　　资料和方法

　　1.临床资料收集2017年6月至2018年9月在新疆维吾尔自治区人民医院口腔科和乌鲁木齐市口腔医院牙周科就诊的慢性牙周炎患者42例。纳入标准：①符合为慢性牙周炎(根据Armitage1999年新分类诊断)慢性牙周炎诊断标准且全身状况良好;②年龄18~56岁;③全口至少10颗牙齿可进行牙周评价;④6个月内未接受过牙周治疗或服用过免疫调节剂、抗菌药物;⑤患者依从性强且资料完善，自愿参加。排除标准：①精神疾病、意识障碍;②吸烟史;③免疫相关性疾病;④妊娠及哺乳期女性;⑤糖尿病史、高血压病史和2个月内急性感染病史。纳入30例牙周健康者作为对照组，均是非牙周病患者或健康志愿者，牙周探诊深度均小于3mm,无临床附着丧失,X线检查无牙槽骨吸收。否认吸烟所有研究对象自愿签署知情同意书(伦理批件号：2016029)。研究对象的一般资料见表1。2.主要试剂CD3-FITC、CD4-PE、IL-17-PerCP5.5、IL-17-PerCP5.5抗人单克隆抗体及相应的同型对照抗体、破膜剂(Permeabilizationbuffer)、固定液缓冲液Fixation(Biolegend公司，美国);佛波酯(propyleneglycolmonomethyletheracetate，PMA)、离子霉素(Ionomycin)、蛋白转运抑制剂(BrefeldinA)(Sigma公司，美国);淋巴细胞分离液(天津华科生物有限公司);CCR6、CCL20、IL-17ELISA试剂盒(R&D公司，美国)。3.主要设备FACSCantoTMII流式细胞仪、肝素钠抗凝真空采血管(BD公司，美国);HEALFORCE超净工作台(上海力新公司);台式离心机(Heraeus公司，德国);相差倒置显微镜(Olympus公司，日本);微量移液器(Eppendor公司，德国)。4.研究方法流式细胞术分析Th17细胞：清晨入选患者空腹抽取静脉血3ml于抗肝素钠采血管中，离心吸取血浆备细胞因子检测，采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞。RPMI-1640培养液稀释单个核细胞终浓度至少l×106/ml。取悬浮细胞于48孔板中，分别加入刺激剂PMA(终浓度25ng/ml)及离子霉素(终浓度1μg/ml)培养1h后加入BFA工作液(终浓度10μg/ml)培养4h，混匀细胞悬液，流式管中加入100μl刺激后的细胞、CD3-FITC、CD4-PE抗体室温避光孕育20min;洗涤，加入固定液500μl，孕育20min，洗涤，加入2ml膜剂孵育20min，洗涤，加入100μl破膜剂重悬细胞，加入抗体IL-17PerCP-5.5，避光孵育20min，洗涤，上流式细胞仪检测。ELISA检测CCL20、CCR6、IL-17：采用双抗体夹心ELISA法测定血浆CCL20、CCR6及IL-17的浓度。按照说明书操作，建立标准曲线，通过酶标仪测定450nm光密度值，根据标准曲线计算血浆CCL20、CCR6及IL-17浓度。5.统计学方法用SPSS22.0进行分析，两样本比较，数据符合正态分布，满足方差齐性检验使用独立样本t检验，数据以x±s表示。各组间线性相关性分析采用Pearson相关分析，P<0.05认为差异有统计学意义。

　　结果

　　1.外周血Th17表达、CCL20、CCR6及IL-17浓度比较通过流式细胞术检测外周血慢性牙周炎患者和健康者Th17表达，典型流式细胞图见图1所示。ELISA检测CL20、CCR6及IL-17浓度。结果表明慢性牙周炎患者外周血Th17细胞表达(0.44±0.15)%高于对照组(0.29±0.10)%;病例组CCL20浓度[(237.53±66.25)pg/L]高于对照组[(174.07±65.23)pg/L];病例组CCR6浓度[(117.03±34.69)pg/L]高于对照组[(95.37±28.59)pg/L];病例组IL-17浓度[(111.42±29.84)pg/L]高于对照组[(93.04±18.01)pg/L]，差异均具有统计学意义(P<0.05)(图2)。2.相关性分析对CCL20表达与Th17、IL-17细胞进行线性相关性分析，表明CCL20表达与Th17、IL-17细胞呈正相关性(P<0.05);Th17、IL-17与PD进行线性相关性分析，表明Th17、IL-17与PD均成正相关关系(P<0.05)(图3)。

　　讨论

　　慢性牙周炎是发生在牙齿支持组织的慢性感染性疾病，宿主免疫因素在疾病发生发展中的作用近年日益受到关注。本课题组前期研究结果显示，慢性牙周炎患者外周血中Thl细胞和Thl7细胞数量升高，血浆中IL-17较牙周健康者明显升高，Th1与Th17细胞呈正相关关系，且两种细胞与牙周探诊深度亦存在正相关关系[4]。Th17高分泌的IL-17是发挥促炎的主要媒介，IL-17通过激活下游NF-кB、MAPKs、C/EBPs信号传导通路，诱导成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞表达促炎因子、趋化因子及基质金属蛋白酶参与免疫炎症反应，引起炎性细胞浸润和组织破坏[6]。此外，还可以产生IL-6、IL-21、肿瘤坏死因子(TNF)-α和CCL20等效应因子，同时也表达趋化因子受体CCR6[5]。近年来Thl7细胞所分泌的IL-17在许多慢性炎症性疾病中研究甚多，如类风湿性关节炎[8]、乙型肝炎[9]和牙周炎[10]等均发挥极为重要的作用。本研究结果显示血浆中IL-17浓度增高，分析原因可能是患者由于受到牙周致病菌的侵袭，激活自身免疫应答反应，导致诱导产生大量IL-17，提示促炎性细胞因子参与了牙周炎的病变过程。采用流式细胞术进一步检测，炎症组织破坏除IL-17发挥促炎作用外，CCL20、CCR6表达亦升高，外周血Th17百分比较对照组也明显升高，推测Th17可能通过CCL20-CCR6趋化作用发挥促炎效应。趋化因子是一种可被诱导起促炎作用的细胞因子，维持树突状细胞(DC)、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞等的迁移[11]。CCL20作为趋化因子，具有专一的受体CCR6，其主要表达在未成熟树突状细胞(iDCs)、B细胞、T细胞及多种肿瘤细胞[12]。两者结合后发挥趋化作用募集免疫细胞，其中包括Th17细胞，通过自分泌或旁边分泌CCL20，与其表面分子受体CCR6结合将自我招募到炎症组织，并且IL-17促进组织CCL20产生，提示CCL20在持续Thl7细胞介导的炎症反应中扮演着重要的角色[13]。已知Thl7细胞在包括EAE在内的多种自身免疫性疾病中具有重要作用，而CCR6则介导了其向免疫反应局部的迁移。有报道，类风湿关节炎和免疫性疾病患者体内Th17表达趋化因子受体CCR6，同时病变组织局部则表达了其特异性配体CCL20[14,15]。另外，在肝细胞癌转移浸润的患者研究中，也发现患者肝细胞中CCL20和CCR6的表达明显上升，并对外周血表达CCR6的T细胞具有趋化作用[16]。本研究结果发现，慢性牙周炎患者血清中CCL20、CCR6浓度及Th17细胞表达水平较正常组明显升高。进一步相关性分析发现，Th17细胞比例与CCL20和牙周探诊深度之间呈正相关关系，且差异具有统计学意义。分析认为，大量的IL-17能显著促进CCL20的产生，作为趋化因子将招募更多的Th17细胞向炎症组织迁移和浸润，进一步促进自炎症性疾病的产生和发展，本结果与谢湘江[17]研究一致。相关性分析示血清中CCL20与IL-17存在显著正相关性，提示IL-17作为促炎症因子在血清中高水平的存在，可能促进黏膜、外周血、上皮细胞等产生CCL20，随着CCL20的积图3外周血CCL20、Th17、IL-17与PD的相关关系A：CCL20与Th17相关性r=0.311;B：Th17与PD相关性r=0.500;C：CCL20与IL-17相关性r=0.677;D：IL-17与PD相关性r=0.325注：*：与正常对照组比较，P<0.05图2病例组和正常对照组外周血Th17、CCL20、CCR6及IL-17浓度A：Th17百分比;B：IL-17浓度;C：CCL20浓度;D：CCR6浓度累，将趋化更多的CCR6+免疫细胞定向迁移，迁移活化的炎症细胞又分泌更多的细胞因子，其中包括Th17细胞自身。Th17细胞相关细胞因子参与牙周组织自身免疫反应，进一步放大局部炎症反应，如此便形成一个CCL20-CCCR6与Th17的循环回路，介导炎性趋化促进牙周炎的发生发展，我们认为CCL20-CCR6及Th17参与了牙周炎的发生，并与疾病进展有关。本研究结果只是初步探讨CCL20-CCR6与Th17参与慢性牙周炎的发生、发展。CCL20-CCR6结合发挥趋化效应将Th17细胞招募到牙周微环境中发挥促炎作用，但其在疾病的不同发病阶段的具体作用,及与其他炎症介质如细胞因子、趋化因子及免疫细胞之间的相互作用仍需进一步研究。

　　作者：赵莉 杨柯 李宝坤 王紫莹 陈晓涛

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