论文《PAK1基因与皮肤鳞状细胞癌研究》-仁创编译转载
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摘要：目的探讨短发夹RNA(shRNA)沉默p21活化激酶1(p21-activatedkinase1，PAKl)基因对皮肤鳞癌A431细胞系迁移及侵袭能力的影响。方法合成PAKl特异性shRNA(PAK1-shRNA)和通用无义shRNA序列(NC-shRNA)，转染A431细胞;随机将A431细胞分为空白对照组A431组、阴性对照组NC-shRNA-A431组及转染组pG1.1-PAK1-shRNA-A431组，转染细胞后，通过RT-PCR、WB检测比较空白对照组、阴性对照组及转染组细胞PAK1mRNA、蛋白表达水平的差异;Transwell法检测转染后细胞迁移及侵袭能力的变化。结果成功转染A431细胞后，RT-PCR及WB检测结果表明，转染组pG1.1-PAK1-shRNA-A431较空白对照组A431组、阴性对照组NC-shRNA-A431组的PAK1mRNA水平及蛋白表达水平表达均明显下调;Transwell检测细胞迁移及侵袭能力结果显示，pG1.1-PAK1-shRNA-A431组细胞迁移及侵袭细胞数量较空白对照组A431组、阴性对照组NC-shRNA-A431组明显减少。结论shRNA干扰PAK1基因能使A431中的PAK1表达量明显下调，并可明显降低A431细胞的迁移及侵袭能力。提示PAK1可能作为一个潜在的无创性分子指标来评价鳞状细胞癌的侵袭能力。
关键词：皮肤鳞状细胞癌;A431细胞;p21活化激酶1
p21活化激酶1(p21-activatedkinases1，PAK1)是丝氨酸/苏氨酸蛋白质磷酸化激酶家族的成员，在细胞迁移、侵袭等多种生物学过程中起重要作用[1]。PAK1在皮肤鳞状细胞癌中高表达，在低分化及侵袭性强的组织中表达更高，提示PAK1可能参与皮肤鳞状细胞癌的侵袭进展。我们通过体外靶向下调PAK1在鳞状细胞癌A431细胞系中的表达，观察其对细胞的迁移及侵袭能力的影响，探讨PAK1是否可作为一个潜在的无创性分子指标来评价皮肤鳞状细胞癌的迁移侵袭能力。
1材料与方法
1.1主要材料与试剂试验中A431细胞系为本实验室保存;胎牛血清、DMEM培养基来自美国Gibco公司;Trizol总RNA提取试剂盒及PCR扩增试剂盒来自大连宝生物工程有限公司;Lipofectamine2000脂质体转染试剂来自美国Invitrogen公司;反转录试剂盒及BAC蛋白定量试剂盒来自美国Thermo公司;Transwell小室来自美国Coming公司Matrigel基质胶室来自BDBiocoatTM。1.2A431细胞培养皮肤鳞状细胞癌细胞系A431来自美国标准生物品收藏中心(ATCC)，在本课题组实验室保存，采用含10%胎牛血清、青霉素链霉素双抗的高糖Dulbecco极限必需培养基DMEM进行培养，培养条件为37℃、5%CO2，使用胰酶消化传代，取对数生长期、生长状态好的细胞试验。1.3A431细胞的转染选择处于对数生长期、生长状态良好的A431细胞，以每孔5×105个接种于细胞培养6孔板，37℃、5%CO2条件下培养箱中培养过夜。设置3组细胞：空白对照组A431细胞组、阴性对照组NC-shRNA-A431细胞组及转染组pG1.1-PAK1-shRNA-A431细胞组。1.4RT-PCR检测转染后A431细胞PAK1mRNA表达转染A431细胞48h后，Trizol提取总RNA，参照TaKaRa反转录试剂盒的说明书反转录，RT-PCR检测转染后细胞中PAK1mRNA表达水平，PAK1基因正向引物5'-GATGCTGGAACCC-TAAACCA-3'，反向引物5'-TCTGGCATTCCCG-TAAACTC-3'，所产生的目标产物为215bp;内参选用GAPDH，其正向引物5'-TCAAGAAGGTGGT-GAAGCAGG-3'，反向引物5'-TCAAAGGTGGAG-GAGTGGGT-3'，目标产物115bp。RT-PCR上机反应条件：50°C2min;95°C10min;95°C30s;60°C30s，重复40个循环。同时设置3个复孔，最终数据以2-△△Ct进行分析PAK1mRNA相对表达量，并进行相关统计分析。1.5WB法检测转染后A431细胞中PAK1的蛋白表达量转染A431细胞72h后，收集3组细胞，裂解液裂解细胞，并收集细胞上清;BCA蛋白测定法检测细胞上清蛋白浓度，根据浓度计算上样量;然后取等量蛋白，在10%SDS.PAGE凝胶中电泳后，转膜至转聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，封闭1h，孵育一抗，4℃过夜;TBST洗膜3次，孵育二抗，1h后洗膜，曝光。应用ImageJ分析软件进行灰度条带分析。1.6细胞迁移实验及侵袭实验收集三组A431细胞，倒置显微镜下计数后，并按5×103细胞/L接种于Transwell小室的上室，下室加入约700mLDMEM培养液(15%)，置于细胞孵育箱中继续培养20h，然后取下室，常规固定及染色，最后在显微镜下随机取5个视野，统计穿出小室的细胞数并进行统计分析细胞迁移能力变化。在Transwell小室上室铺稀释后的无血清基质胶，其中无血清DMEM培养液与基质胶配比为1∶4，并置于细胞孵育箱中，待基质胶充分凝固后进行细胞侵袭实验，具体实验方法和统计分析方法与上述迁移实验相同。1.7统计学方法采用SPSSl6.0统计软件进行分析，实验数据以表示，作方差齐性检验，采用单因素F检验和SNK检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1质粒表达载体转染A431细胞转染A431细胞48h后进行细胞爬片，荧光显微镜下观察NC-shRNA-A431组及转染组pG1.1-PAK1-shRNA-A431组细胞，发现两组均有数量、亮度不同的细胞，其中绿色荧光即是成功转染的阳性细胞，空白对照组无绿色荧光。见图1。图12.2RT-PCR方法检测转染后细胞中PAK1基因的表达A431细胞转染实验后进行RT-PCR检测，结果显示，与空白对照组A431细胞PAK1mR-NA表达量(1.05±0.08)相比，NC-shRNA组A431细胞mRNA表达量(1.02±0.06)差异无统计学意义(F=0.42，P>0.05)，转染组PAK1-shRNA组A431细胞mRNA表达量(0.37±0.05)差异具有统计学意义(F=169.93，P<0.05)。见图2。2.3WB检测转染后PAK1及p-PAK1蛋白表达情况A431细胞转染实验后进行WB检测，结果显示，与空白对照组A431细胞PAK1及p-PAK1蛋白表达量(0.80±0.03;0.40±0.02)相比，NC-shRNA组A431细胞PAK1及p-PAK1蛋白表达量(0.77±0.04;0.38±0.01)差异无统计学意义(F=1.34，P>0.05;F=6.011，P>0.05)，pG1.1-PAK1-shRNA组A431细胞PAK1及p-PAK1蛋白表达量(0.65±0.03;0.21±0.03)降低(F=33.65，P<0.05;F=155.05，P<0.05)。见图3。2.4PAK1-shRNA干扰后对细胞迁移、侵袭能力的影响转染A431细胞后，应用Transwell法检测细胞迁移能力，结果显示，与空白对照组A431细胞(30.08±1.64)，NC-shRNA组A431细胞(31.4±1.82)迁移能力差异无统计学意义(F=0.30，P>0.05)，pG1.1-PAK1-shRNA组A431细胞(12.2±0.84)迁移能力降低(F=508.76，P<0.05)。用同样方法分析细胞侵袭能力发现，与细胞迁移能力结果相似，细胞侵袭能力亦明显下降，Transwell检测细胞侵袭显示，与空白对照组A431细胞(24.4±2.61)相比，NC-shRNA组A431细胞(23.4±2.07)侵袭能力差异无统计学意义(F=0.45，P>0.05)，pG1.1-PAK1-shRNA组A431细胞(7.0±2.74)侵袭能力降低(F=105.86，P<0.05)。见图4。
3讨论
p21活化激酶1(PAK1)基因定位于人染色体11q13.5-14，编码一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，分子量大约为68kDa，是G蛋白Rho家族Cdc42和Rac1下游重要的靶蛋白，激活后形成磷酸化PAK1(p-PAK1)，参与许多重要的细胞活动，如细胞骨架形成、细胞运动及血管形成等。课题组前期研究发现乳房外Paget病中p-PAK1表达水平明显提高，与肿瘤的转移相关[2]。目前认为日光性角化是原位鳞状细胞癌的癌前病变，已有研究发现PAK1在日光性角化皮损中表达明显增高[3]，少数AK临床上可能进展为侵袭性，那么PAK1是否有可能作为日光性角化进一步恶化的评价指标?另外有研究报道PAK1及p-PAK1在皮肤鳞状细胞癌组织中的表达明显增高，且侵袭性强的组织中，增高更明显，因此PAK1可能与鳞状细胞癌的侵袭及转移相关[4]。PAK1是否可以作为预测评估皮肤鳞状细胞癌侵袭的一个指标，用来指导临床?课题组设计了特异性shRNA序列，靶向沉默PAK1基因，成功转染A431细胞后，PAK1的基因及蛋白表达量均明显下调，Transwell小室检测细胞迁移及侵袭结果发现A431细胞的迁移数量及侵袭数量均明显减低。表明沉默PAK1基因表达后，可以明显降低A431细胞的迁移及侵袭能力，进一步通过体外实验证明了PAK1参与皮肤鳞状细胞癌的侵袭及转移过程，PAK1可能会成为评价该疾病发展及预后的检测指标之一。文献报道PAKl通过增加基质金属蛋白酶-9表达，导致细胞外基质破坏重建，促进癌细胞侵袭迁移[5]。也有研究报道PAK1参与细胞骨架形成，进而提高肿瘤细胞的运动、侵袭能力[6]。那么在皮肤鳞状细胞癌中，到底通过哪些途径促进细胞迁移及侵袭，也将是我们进一步研究的重点。综上所述，PAK1参与了皮肤鳞状细胞癌迁移、侵袭进展的过程。通过阻断PAK1表达，有望降低皮肤鳞状细胞癌的转移率，PAK1可能会成为一个潜在的无创性分子指标用于临床。
作者：张娜 李税琪 李红文 单位：郑州大学第一附属医院
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