论文《免疫球蛋白生产工艺对凝血因子的效果》-仁创编译转载

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　　摘要：目的评价低温乙醇及压滤生产工艺对静注人免疫球蛋白(蚤灶贼则葬增藻灶燥怎泽蚤皂皂怎灶燥早造燥遭怎造蚤灶，陨灾陨郧)中凝血因子欲(云欲)的去除效果。方法取怨批次低温乙醇工艺不同阶段分离的血浆蛋白及猿批次云域沉淀精制和制剂阶段的样品，采用部分凝血酶时间(灶燥灶葬糟贼蚤增葬贼藻凿责葬则贼蚤葬造贼澡则燥皂遭燥责造葬泽贼蚤灶贼蚤皂藻，晕粤孕栽栽)试验检测样品中云欲的含量。结果云玉垣域垣芋分离对云欲的去除效率约为远豫，云玉垣芋分离对云欲的去除效率约为员缘源豫，云域分离对云欲的去除效率约为员园豫。半成品中云欲含量稳定，且均低于猿园皂陨哉辕皂蕴。结论低温乙醇及压滤生产工艺能稳定有效地去除陨灾陨郧中的云欲，确保产品质量安全。

　　关键词：静注人免疫球蛋白;低温乙醇工艺;压滤工艺;凝血因子欲

　　静注人免疫球蛋白(蚤灶贼则葬增藻灶燥怎泽蚤皂皂怎灶燥早造燥遭怎鄄造蚤灶，陨灾陨郧)是治疗原发性或继发性免疫缺陷、自身免疫性疾病、血液系统疾病、细菌及病毒感染的特效药物，具有其他药品不可替代的作用[员鄄猿]。有研究表明，陨灾陨郧残存的微量凝血激活物可诱发血栓形成[源]，长期大剂量输注陨灾陨郧增加了血栓的风险[缘]。凝血因子欲(枣葬糟贼燥则欲，云欲)以酶原形式存在，在凝血过程中能被活化的凝血因子载芋活化[远鄄苑]，导致产品促凝血活性升高[愿]。临床发现，云欲升高会形成血栓、脑卒中和心肌梗死[怨鄄员园]。云欲缺乏极易导致口鼻、胃肠道及泌尿生殖道出血[员员鄄员猿]。目前，国内各血液制品公司大多采用低温乙醇及压缩工艺分离纯化血浆蛋白，生产工艺和参数相近，该方法的蛋白分离纯度及收率均较高。人免疫球蛋白采用低温乙醇方法分离富集陨早郧的中间品，通过沉淀或层析等方法进一步分离纯化。本研究通过检测怨个投浆批次及对应猿个组分域沉淀合并精制批次，从血浆蛋白分离纯化到制剂阶段各工艺步骤中的云欲含量，现报道如下。

　　材料与方法

　　员援员样品低温乙醇工艺分离血浆蛋白各阶段样品为成都蓉生药业有限责任公司圆园员源年愿月生产的怨个投浆批次产品;云域沉淀精制和制剂阶段的样品为成都蓉生药业有限责任公司同月生产的猿批次产品。员援圆标准品云欲国际标准品由英国国家生物制品检定所(晕陨月杂悦)提供。员援猿主要试剂及仪器校准血浆、乏云欲血浆、粤孕栽栽试剂、悦葬悦造圆试液、因子稀释液及凝血仪(粤悦蕴耘蕴陨栽耘，月藻糟噪皂葬灶悦燥怎造贼藻则)均由陨灶泽贼则怎皂藻灶贼蕴葬遭燥则葬贼燥则赠悦燥援提供。员援源FⅪ的去除采用改良运蚤泽贼造藻则鄄晕蚤贼泽糟澡皂葬灶灶法[员源]结合压滤工艺(超滤及纳米过滤)分离血浆蛋白。当乙醇浓度为圆园豫时，云玉与云域垣芋共沉淀，云玉垣域垣芋沉淀作为原料分离纯化人免疫球蛋白。云玉垣域垣芋沉淀复溶后，当乙醇浓度调整至员源豫，杂蛋白以云玉垣芋沉淀的形式去除;当云玉垣芋上清的乙醇浓度为圆缘豫，收集云域沉淀;再经云域沉淀复溶、精制、超滤配制、低责匀孵放、纳米过滤等步骤，除菌分装为成品。员援缘FⅪ含量的检测采用非活化的部分凝血酶时间(晕燥灶葬糟贼蚤增葬贼藻凿责葬则贼蚤葬造贼澡则燥皂遭燥责造葬泽贼蚤灶贼蚤皂藻，晕粤孕栽栽)试验[员源]。在比色盘中加入样品和乏Ⅺ因子血浆，用粤孕栽栽试剂及悦葬悦造圆激活，通过远远园灶皂波长测定比色盘中样品的凝固时间，样品凝固时间的对数与样品中云欲含量的对数成反比。应用酝蚤糟则燥泽燥枣贼耘曾糟藻造圆园员园进行数据处理，数据均以均数依标准差(x依s)表示。

　　结果

　　圆援员低温乙醇及压缩工艺血浆蛋白分离阶段各工艺步骤样品的FⅪ含量合并血浆云欲含量检测值为远愿源耀愿猿苑皂陨哉辕皂蕴。云玉垣域垣芋过滤分离后，云玉垣域垣芋沉淀溶解液(分离制作球蛋白)的云欲含量各批次之间有差异，且明显较云玉垣域垣芋上清液(分离制作白蛋白)高，平均值达怨苑援远皂陨哉辕皂蕴，云玉垣域垣芋分离对云欲的去除效率约为远豫。随着云玉垣芋过滤分离和沉淀废弃，云玉垣芋上清液中云欲含量稳定且显著降低。云玉垣芋(废弃)沉淀复溶后，其云欲含量较高，平均达员源愿皂陨哉辕皂蕴，云玉垣芋分离对云欲的去除效率均约员缘源豫。云域沉淀收集并复溶后，云域沉淀溶解液、云域沉淀精制过滤液的云欲含量趋于稳定，考虑制作体积后，云欲总量在精制过滤前后未发生变化，云域分离对云欲的去除效率约为员园豫。见表员。圆援圆IVIG制剂阶段各工艺步骤FⅪ含量经云域精制深层过滤后，产品制作体积在制剂阶段变化不大，各步骤的云欲含量也相对一致，在圆缘援园耀猿园援园皂陨哉辕皂蕴范围内，见表圆。表明制剂阶段的各生产步骤均不能有效去除云欲。

　　讨论

　　低温乙醇工艺血浆蛋白分离阶段各工艺步骤样品中，合并血浆云欲含量检测值远愿源耀愿猿苑皂陨哉辕皂蕴，与文献报导的云欲含量范围一致[员圆]。由于分离阶段部分云欲可能由于乙醇、责匀变化等因素失活或活化。云玉垣域垣芋分离后残留的云欲活性总量为员怨豫，其中员猿豫分布在云玉垣域垣芋沉淀中，远豫分布在云玉垣域垣芋上清。经云玉垣芋分离后，残留的云欲活性总量为圆怨豫，其中圆园豫分布在云玉垣芋沉淀中(废弃)，怨豫分布在云玉垣芋上清。经云域过滤以及精制后，滤过液中残留的云欲活性总量已降低至约园援怨豫。低温乙醇生产人免疫球蛋白时对云欲去除的工艺步骤体现在：淤压滤分离云玉垣域垣芋上清与云玉垣域垣芋沉淀时，低温乙醇法通过调整蛋白质溶液的介电常数、温度、责匀，同时由于云欲与球蛋白等电点相近，结合压滤工艺大部分云欲进入云玉垣域垣芋沉淀中;该分离步骤对云欲的去除效率约为远豫。于由于云玉垣域垣芋沉淀溶解液中云欲含量是在沉淀溶解后直接测定的(未经过后续参数调整)。生产中云玉垣域垣芋沉淀溶解液中含有较多的硅藻土，其表面带有负电荷会激活凝血因子[员缘]，同时沉淀复溶以及制品温度升高，溶液责匀、电导、乙醇浓度等参数的调整，会导致部分云欲活化。因此经过参数调整后的云玉垣域垣芋沉淀溶解液中活化的云欲含量会增加(大于员猿豫)，后经过压滤分离云玉垣芋上清与云玉垣芋沉淀，绝大部分云欲进入废弃的云玉垣芋沉淀中(高达圆园豫);该分离步骤对云欲的去除效率约为员缘源豫。盂云域分离以及精制阶段进一步去除残余硅藻土以及少量云欲等杂蛋白，滤过液进入制剂阶段云欲含量稳定在较低水平;该分离步骤对云欲的去除效率均约为员园豫。结合云欲去除效率分析，云玉垣芋压滤分离步骤对云欲的去除效果是最大的。低温乙醇法通过调整工艺参数使目标蛋白富集在固相或液相中，压滤分离沉淀和上清液，当沉淀为废弃组分时，可有效去除杂质。过滤过程中使用的硅藻土等助滤剂对热原、脂类、蛋白酶和变性蛋白均有较好的吸附作用，确保了制品的安全性和质量[员远]。过滤时使用的滤板(主要成分为高纯度纤维素、硅藻土)对杂蛋白也有吸附和拦截作用。在球蛋白分离过程中，云玉垣芋分离步骤能够有效地去除病毒[员苑]，同时结合使用深层滤板能进一步去除云欲等杂质。在后续的云域精制步骤中，可进一步去除云域以外的其他成分，确保制品进入超滤工艺阶段时云欲已得到有效去除，保证产品在血栓栓塞事件(贼澡则燥皂遭燥藻皂遭燥造蚤糟藻增藻灶贼，栽耘耘)方面的安全性(由于半成品加入稳定剂后进行分装即为成品，半成品质量属性与成品一致，未检测成品中云欲含量)。目前，中国，欧洲、日本和美国最新版药典尚未建立关于人陨灾陨郧的凝血激活物水平的强检规定。郧RUNDMANN等[员愿]报道，引起栽耘耘的特定批次陨灾陨郧韵糟贼葬早葬皂产品中，云欲活性为愿园耀员园园皂陨哉辕皂蕴。而其他未引起栽耘耘厂家陨灾陨郧中，云欲活性均低于源园皂陨哉辕皂蕴。成都蓉生药业有限责任公司制备的陨灾陨郧半成品中云欲含量稳定并低于猿园皂陨哉辕皂蕴，表明现有的陨灾陨郧生产工艺可有效去除云欲，且截至目前，未收到与栽耘耘相关的顾客投诉及国内外的药品不良反应报告。对于特殊人群，尤其是需要长期、大量输注的患者，云欲含量小于源园皂哉辕皂蕴的陨灾陨郧产品的安全性仍需进一步深入研究。同时将进一步考察生产过程及货架期云欲是否被活化，继续开展各生产工艺步骤对该类凝血激活物去除能力的研究，进而分析相关产品的凝血激活物水平，以期对国内陨灾陨郧制品在促凝血方面的安全性进行评价，为提高制品质量标准提供了参考。

　　作者：杨帆 欧阳平 白光明 陈棚 兰学渊 单位：成都蓉生药业有限责任公司

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