论文《育龄期妇女人布法细小病毒感染探讨》-仁创编译转载
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摘要：目的探究新发病毒人布法细小病毒(HBuV)在育龄期妇女血清中的病毒DNA检出率，并分析该病毒与育龄期妇女妊娠的潜在关系。方法以251例育龄妇女为研究对象，利用巢式PCR技术检测血清中的HBuV病毒DNA并进行统计学分析。结果HBuV在全部育龄期妇女血清中的病毒DNA检出率为9.16%，但是该病毒与育龄期妇女的非正常妊娠并无直接的关系。结论本研究揭示了HBuV在成人，尤其是育龄期妇女血清中的病毒DNA检出率，对了解该病毒的流行病学分布、育龄期妇女临床病毒检测及血制品安全性检测具有重要的指导意义。
关键词：人布法细小病毒;育龄期妇女;巢式PCR
人布法细小病毒(humanBufaparvovirus,HBuV)属细小病毒科原细小病毒属中发现的能感染人的三个新成员之一[1]。该病毒是2012年在西非布基纳法索对患有急性腹泻的儿童粪便样品进行高通量宏基因组检测时被发现的，在轮状病毒抗原阴性的儿童粪便样品中，该病毒的阳性检出率约为4%，被认为是引起儿童腹泻的重要病原[1]。血清学流行病检测显示，芬兰和美国普通成人的HBuV的阳性率分别为1.9%~5.6%和3.6%[2]，但亚洲和非洲国家成人的阳性率达到56.1%~84.8%[3]，表明HBuV在亚洲的流行性极显著于欧美国家[4]。目前，除了人布法病毒外，还在蝙蝠、犬、鼠、猪以及非人类的灵长类动物中发现了相应的布法病毒[5-7]。例如，我国首次在猪的血清样本中鉴定出布法病毒DNA[8]。目前，除人粪便样本外，还在咽拭子样本中发现了较低含量的病毒DNA，但在其他组织和血清中病毒DNA的检测尚未见报道[1]。因此，探究新发病毒HBuV在人血清中的病毒DNA检出率十分必要。本研究以251例育龄妇女为研究对象，利用巢式PCR技术对血清中HBuV病毒DNA进行了检测，具体检测结果详述如下。
1材料与方法
1.1材料与试剂选取2018年1月至2019年8月在襄阳市中心医院产科、妇科和生殖医学科就诊的孕前、产前检查以及孕育治疗的育龄期妇女251例，其中正常妊娠95例，不孕症90例，胎儿流产36例，其他的胎膜早破、异常妊娠等女性30例;年龄17~50岁，平均年龄(29.91±4.82)岁。收集进行血常规检测的血液样品，经离心操作后取1~2mL血清并置于-80℃保存备用柱法病毒DNA抽提试剂盒(MAGEN)，2×HieffTMPCRMasterMix(翊圣生物)，PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，HBuVns1DNA片段由武汉金开瑞生物工程有限公司合成。1.2HBuV病毒DNA的提取每250μL血清加入等体积结合缓冲液(BufferAL)，3μLCarrierRNA(1μg/μL)，20μL蛋白酶K(20mg/mL)，250μL无水乙醇，65℃温育30min;8000×g离心1min，转移上清至DNA纯化柱，8000×g离心1min;加入500μL抑制剂去除缓冲液(BufferGW1)，6000×g离心1min;450μL洗涤缓冲液(BufferGW2)离心洗涤纯化柱两次;50μL洗脱缓冲液(ElutionBuffer)于13000×g离心1min洗脱，并储存于-20℃。1.3巢式PCR法检测HBuV1病毒DNA根据发表于NCBI基因库HBuV1基因组序列(JQ918261.1)，在HBuV1的ns1基因保守区设计两对引物ns1-F1/R1，ns1-F2/R2(表1)(注：该引物不能区分HBuV-1/2/3三个亚型)，以血清中提取的HBuV病毒DNA作为模板，通过巢式PCR检测血清样本是否含有HBuV病毒。第一轮PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，72℃延伸10min;待第一轮PCR循环结束后，取2μLPCR扩增产物作为第二轮PCR反应的模板，以引物F2/R2代替F1/R1，退火温度60℃，其余反应条件均不变。两轮PCR反应体系均为20μL，包括2μL提取DNA，10μL的2×TaqPCRMix，正反引物各0.5μL×50mM，7μLddH2O。1.4统计学方法采用SPSS17.0统计学软件进行数据分析，计数资料用n/%表示，用χ2检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2结果
2.1血清样本中HBuV1病毒DNA的巢式PCR检测与电泳分析利用巢式PCR对提取的病毒DNA进行检测，对第二轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，部分样品的电泳检测结果如图1，其目的片段大小为327bp。2.2育龄期妇女的HBuV病毒DNA检测结果分析对全部251例血清标本进行巢式PCR检测与统计分析，发现23例标本显示HBuV阳性，阳性率为9.16%。同时，按照提供的医学检查信息，将全部妊娠妇女分为正常妊娠组、不孕组及异常妊娠组，统计结果显示各组HBuV病毒DNA检出率分别为13.68%、7.78%和4.55%。正常妊娠组与异常妊娠组的病毒DNA检出率无显著差异(χ2=3.63，P>0.05);正常妊娠组与不孕组的病毒DNA检出率无显著差异(χ2=1.95，P>0.05);异常妊娠与不孕组的病毒DNA检出率无显著差异(P>0.05)。2.3不同年龄段育龄期妇女的HBuV病毒DNA检测结果分析为探究HBuV病毒DNA与育龄期妇女年龄之间的关系，本研究将全部样品分成6组：≤20岁、21~25岁、26~30岁、31~35岁、36~40岁和≥41岁。除去1例未知年龄，统计分析结果显示，随着女性年龄的增长，其在怀孕期间感染HBuV的风险就越大(注：≥41岁组由于样品量较少除外)。不同年龄段育龄期妇女的病毒DNA检出率无显著差异(P>0.05)。见表3。
3讨论
作为原细小病毒属中新发现的能感染人的三个新成员，HBuV、HTuV和HCuV均为在患有急性腹泻的儿童粪便样品进行高通量宏基因组测序检测时被发现[1]，目前针对这些病毒的体外细胞培养仍未有报道。鉴于人类细小病毒如B19、HBoV的细胞趋性以及在细胞培养时较低的增殖效率，基于科赫法则对人类细小病毒致病性的检测具有很强的局限性，因此，通过病毒DNA检测以及抗体的血清学检测是目前研究新发人细小病毒的有效方法。HBuV被普遍认为可能是引起儿童腹泻的病原，因此，目前的病毒DNA检测主要集中于儿童的粪便样品，其阳性检出率为0.3%~4.1%[1]。目前国内关于成人HBuV病毒DNA检测较少，北京总医院的一份粪便样品中的HBuV病毒DNA检出率只有1.7%。而基于血清学的检测HBuV在亚洲的流行性极显著于欧美国家[3-4]。本研究中，HBuV在全部育龄期妇女血清中的病毒DNA检出率为9.16%，显著高于已知的粪便样品中病毒DNA检出率，但与上述血清学检测反映的亚洲国家病毒阳性率显著高于欧美国家一致。值得注意的是，本研究中正常妊娠组病毒阳性率约为异常妊娠组的2倍，但是统计学检验表明二者差异不具有统计学意义，因此，本研究结果提示HBuV病毒DNA检出率与育龄期妇女的非正常妊娠不具有直接关系。笔者推测病毒DNA在异常妊娠组的检出率较低可能与机体免疫系统的变化导致的血清中病毒DNA含量降低或与样本量不多有关。综上所述，本研究揭示了新发病毒HBuV在成人，尤其是育龄期妇女血清中的病毒DNA分布，这对该病毒的流行病学研究、育龄期妇女临床病毒检测及血制品安全性检测具有重要的指导意义。
作者：郭冲 张曦 王艺静 熊奥 柯峰 戈勇 王媛 单位：湖北文理学院医学院 襄阳市中心医院
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